ДРУГИЕ ГОРМОНАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА РАСТЕНИЙ.

Брассиностероиды

Еще в 1930-1940-е годы была высказана догадка о том, что в растениях можно обнаружить стероидные регуляторы роста (по аналогии со стероидными гормонами животных). В многочисленных биотестах растения подвергали обработке тестостероном или эстрогеном, которые оказывали физиологическое действие. Например, эстрогены вызывали деления клеток в зародышах гороха, а с попомщью тестостерона удалось изменить пол у растений шпината (с женского на мужской) и хвоща (тестостерон вызывал дифференцировку архегониев на заростках). Однако, животные гормоны приходилось использовать в слишком высоких концентрациях (порядка 0.1%), и вряд ли можно было говорить о специфичности полученных результатов. Выделить физиологически активные стероиды из растений долгое время на удавалось.

Однако попытки выделить фитогромоны стероидной природы не прекращались. В 1979 г. Гроув с соавт. (Grove et al.) обнаружили, что масляный экстракт из пыльцы рапса (Brassica napus) стимулировал рост проростков в длину. Пришлось собрать около 10 кг пыльцы рапса и выделить оттуда всего 4 миллиграмма действующего вещества! Это оказалось стероидное соединение. От латинского названия рапса вещество было названо брассинолидом, а все похожие на него вещества с физиологической активностью называют брассиностероидами.

В дальнейшем число известных брассиностероидов стало быстро увеличиваться. Из настоящего каштана (Castanea sativa) был выделен кастастерон, из рогоза (Typha) - тифастерол, из чая (Thea) - теастерон, из катарантуса (Catharanthus) - катастерон и т.д. В настоящее время известно более 60 соединений с брассиностероидной активностью.

Биосинтез брассиностероидов идет по мевалонатному пути и включает общие для других терпеновых соединений стадии: изопентенилпирофосфат, геранилпирофосфат, фарнезилпирофосфат, сквален. Первым специфическим продуктом, из которого происходит биосинтез остальных брассиностероидов, является 24-метиленхолестерол превращающийся в кампестерин и кампестанол. От кампестанола расходятся две параллельные ветви биосинтеза, часто одновременно сосуществующие в растительных клетках: с ранним и с поздним окислением в С-6 положении. В итоге обе ветви биосинтеза заканчиваются брассинолидом - физиологически активным брассиностероидом.

Многие из ферментов биосинтеза брассиностероидов былы выделены и охарактеризованы благодаря мутациям, приводящим к карликовости, восстанавливаемой брассинолидом. Так, у арабидопсис мутации dwf 1 (от dwarf - карлик) и dwf 6 контролируют ранние этапы биосинтеза (до разделения на "ранний" и "поздний" путь биосинтеза) и обладают наиболее сильным фенотипическим проявлением - мутанты достигают не более, чем 1/30 высоты растений дикого типа. Мутация dwf 4 затрагивает более поздние этапы (после развилки в метаболизме), поэтому фенотипическое проявление карликовости мягче.

Брассиностероиды - высокогидрофобные молекулы. Тем не менее, при добавлении меченого брассинолида наблюдается транспорт по побегу в акропетальном направлении. Зарегистрировано образование гидрофильных гликозидов, сульфатов и ацилпроизводных брассиностероидов. Все эти формы могут транспортироваться по растению. Хотя ферменты биосинтеза брассиностероидов обнаружены почти во всех тканях растения, их концентрация наиболее высока в молодых тканях: этиолированных проростках, меристемах, флоральных примордиях, развивающейся пыльце. По-видимому, такое распределение брассиностероидов вызвано процессами дальнего и ближнего транспорта.

Ответы на брассиностероиды полностью подавлены у мутанта арабидопсиса bri 1 (brassinisteroid insensitive). Анализ аминокислотной последовательности соответствующего белка показал большую гомологию с трансмембранными рецепторными киназами: в белковом продукте BRI 1 есть лигандный, трансмембранный и протеин-киназный домены. Однако, до сих пор не показано, что брассиностероиды могут непосредственно связываться с этим белком, поэтому проблема рецептора брассиностеродидов пока еще не решена окончательно.

Брассиностероиды (как и ауксины) действовали на проростки, усиливая растяжение. Причем, если для ауксинов характерно быстрое растяжение, при котором активация Н⁺-помпы наблюдается через 10 мин с максимумом растяжения через 30-45 мин после воздействия, то для брассиностероидов типична более замедленная реакция, которая начинается через 30 мин после воздействия и продолжается в течение 1.5-2 часов. Если добавлять брассиностероиды совместно с ауксинами, то они вызывают гораздо больший эффект, чем при действии только ауксинов или только брассиностероидов.

На молекулярном уровне эффект растяжения по-видимому обусловлен активацией генов ксилоглюкан-эндотрансгликозилаз (КсЭТ). Активация таких генов показана в разных растительных объектах. Это ген TCH 4 арабидопсис, ген BRU 1 сои и др. Белки КсЭТ после биосинтеза направляются в клеточную стенку, и при взаимодействии с ксилоглюканами размягчают матрикс клеточной стенки. Таким образом, если ауксины запускают процесс растяжения, то брассиностероиды важны для его длительного поддержания.

Связанные с этим явлением эффекты - частичная и полная мужская стерильность при недостаточности брассиностероидов. У многих растений, мутантных по генам биосинтеза брассиностероидов, тычиночные нити не достигают нужной длины, достаточной для самоопыления. Но даже в том случае, когда пыльцевые зерна попадают на поверхность рыльца, рост пыльцевой трубки существенно замедлен.

Брассиностероиды взаимодействуют не только с ауксинами, но и с гиббереллинами, усиливая растяжение клеток.

При повреждении биосинтеза брассиностероидов проростки заметно уменьшаются в длине. Кроме того, без брассиностероидов растения неспособны удерживать апикальную петельку в согнутом состоянии, семядоли преждевременно раскрываются, биосинтез хлорофилла идет в темноте. Все эти реакции не характерны для растений, выращенных без света. Поэтому обсуждают участие брассиностероидов при передаче световых сигналов (см. ниже) и "перекрестный разговор" путей фоторецепции и брассиностероидов.

Интересно, что брассиностероиды регулируют процессы клеточной дифференцировки. У мутантов bri 1 нарушено формирование столбчатого мезофилла. Кроме того, уменьшено количество проводящих элементов ксилемы. Как и в случае растяжения, акусины запускают процесс дифференцировки ксилемных элементов. В этом процессе можно выделить три стадии: 1) первичная экспрессия генов, приводящая к накоплению фенилаланин-аммикалиазы (ФАЛ) и гидроскилазы коричной кислоты(ГКК); 2) остановка экспрессии этих генов и переориентация актиновых филаментов; 3) вторичный запуск синтеза ФАЛ и ГКК с дальнейшей сильной лигнификацией и программированной гибелью клеток. Оказалось, что переход от стадии 2 к стадии 3 невозможен без брассиностероидов.

Однако, действие на корневую систему брассиностероидов и ауксинов заметно различается: если ауксины стимулируют образование боковых корней, то брассиностероиды ингибируют их образование.

В больших дозах брасииностероиды сдерживают рост и повышают устойчивость к неблагоприятным внешним факторам (перегреву, заморозкам, засухе, инфекции). Этими эффектами пользуются в сельском хозяйстве. Препарат "Эпин", который содержит эпибрассинолид, помогает вырастить более крепкие и здоровые растения.

Жасминовая кислота.

Впервые жасминовая кислота (жасмонат) была выделена из эфирного масла жасмина крупноцветкового, где она присутствует в виде летучего эфира - метилжасмоната, еще в 1962 году. Это достижение фитохимиков осталось бы незамеченным, если бы в 1980-х годах не было обнаружено физиологическое действие этого вещества на растения. Жасмонат и метилжасмонат ингибировали рост проростков, прорастание пыльцевых трубок, образование каллуса, способствовали закрытию устьиц, стимулировали образование клубней и луковиц, влияли на цитоскелет, переориентируя его.

Биосинтез жасминовой кислоты начинается с гидролиза фосфолипидов при активации фосфолипазы А (см. выше). Далее освободившаяся из липидов линоленовая кислота под действием липоксигеназы превращается в перекисное производное и под действием соответствующих ферментов формирует пятиленный цикл, служащий основой для формирования жасмоната. После синтеза жасминовая кислота может метилироваться, переходя в физиологически активный метилжасмонат, но возможно и гликозилирование, и тогда жасмонат переходит в неактивную (запасную) форму.

У арабидопсис обнаружены два гена, ответственные за синтез липоксигеназы: один из них (ATLOX 1) экпрессируется в листьях, корнях, проростках при нормальном развитии и не зависит от внешних условий, тогда как уровень экспрессии второго (ATLOX 2) повышается в растениях в ответ на стресс (механическое повреждение и патогенез). Интересно, что жасмонаты повышают активность липоксигеназы, стимулируя свой собственный биосинтез.

Кроме жасминовой кислоты в растениях обнаружены другие соединения, близкие по структуре и выполняющие те же функции, что и жасмонаты. Это кукурбиновая кислота из тыквы и тубероновая кислота из картофеля. У животных очень близкими по структуре и биосинтезу являются простагландины.

По-видимому, жасмонаты участвуют в двух приниципиально различных регуляторных процессах: (1) сдерживают вегетативный рост и способствуют переходу в состояние покоя и (2) усиливают реакции иммунного ответа.

На молекулярном уровне действие жасмонатов проявлялось как синтез новых белков, многие из которых синтезируются и в ответ на обработку абсцизинами. Во многих ответах АБК и жасмонаты вели себя как синергисты. Так, при воздействии жасмонатами в течение 24 часов и менее подавляется биосинтез белков, связанных с фотосинтезом (например, РБФК), разрушается хлорофилл. За общее подавление биосинтеза белка отвечает (Jasmonate-induced protein массой 60кДа). Появление Jip60 в клетках вызывает разрушение полисом, общее подавление трансляции. Обработка клеток 10^-5М жасминовой кислотой в течение 48 часов и боее вызывает их гибель.

При воздействии на зародыш жасмонаты вызывают синтез белков позднего эмбрионального развития - Late Embryogenesis Abundant proteins (Lea). К уникальной физиологической реакции, запускаемой жасмонатами, относится синтез вегетативных запасных белков - Vegetative Storage Proteins (VSP). Эти белки у некоторых растений совпадают по структуре с запасными белками семян, но у других - заметно отличаются. Причем синтез VSP наблюдается только в условиях хорошего снабжения азотом, а при голодании VSP не откладываются. По-видимому, с помощью жасмонатов растение создает новые временные депо нерастворимых азотных соединений, регулируют донорно-акцепторпные отношения в азотном метаболизме.

Параллельно с VSP и Lea наблюдается синтез белков, характерных для водного дефицита (перекрывающаяся реакция с АБК). Появление этих белков в тканях сопровождается ослаблением флоэмного тока, закрытием устьиц.

Если в растениях ингибировать работу липоксигеназы, жасминовая кислота не образуется. Одним из важных следствий этого нарушения является потеря иммунитета к фитопатогенам.

В иммунном ответе жасминовая кислота вызывает синтез экстенсинов (происходит упрочнение клеточной стенки и замедление роста, что неблагоприятно для патогенов), синтез белков-тионинов (небольшие богатые цистеином белки, связывающиеся с мембранными структурами патогена с токсическим эффектом), синтез фитоалексинов (индуцибельных защитных соединений), фенолов (в частности - салициловой кислоты) и короткого пептида системина (см.далее).

Этерификация жасминовой кислоты придает ей летучесть. Предполагают, что метилжасмонат (как и этилен) через воздушную фазу способен воздействовать на отдаленные ткани растения и на соседние растения, информируя их о нападении патогенов. Растительное сообщество заранее узнает об инфекции и принимает защитные меры.

Салициловая кислота.

Салициловая кислота впервые была выделена из ивы (Salix) еще в XIX столетии, и с тех пор нашла в виде многочисленных производных широкое применение как лекарственный препарат. (Самое известное производное салицилата - аспирин или ацетилсалициловая кислота).

Биосинтез салицилата в растениях начинается с активизации фенилаланин-аммиаклиазы (ФАЛ). При этом фенилалланин превращается в транс-коричную кислоту, которая в результате последовательных окислений дает бензойную кислоту - непосредственную предшественницу салицилата. В конечном счете уровень салицилата зависит от активности гидроксилазы бензойной кислоты. Салицилат может депонироваться в виде неактивного глюкозида.

О физиологическом эффекте салицилатов в растениях стали говорить только в 1980-е годы, когда было подробно изучено явление термогенеза у ароидных. Классический объект исследования - Sauromatum guttatum - субтропическое растение, которое имеет типичную для ароидных стратегию опыления (рис.7.29). Женские генеративные органы собраны на початке у основания. В этом месте базальная часть покрывала образует камеру. Выше на початке расположены щетинки, а покрывало сужено (эта часть початка стерильна). Выше располагаются тычинки (мужская генеративная зона. Початок венчает утолщенный стерильный придаток. Покрывало же отогнуто и образует пестро раскрашенную посадочную площадку для опылителей.

Первый термогенный эпизод начинается около полуночи с нагревания верхнего стерильного придатка и длится приблизительно 7 часов. Перепад температур между початком и окружающей средой достигает 12 градусов. В воздух испаряются вещества, имитирующие запах гниющего органического вещества. На запах слетаются потенциальные опылители, которые по покрывалу забираются в камеру с пестиками. Обратному выходу препятствуют щетинки между женской и мужской частью початка.

Насекомые вынуждены остаться на день в базальной камере, а с вечера их ожидает второй (14-часовой) термогенный эпизод: разогревается нижняя часть початка. Разность температур со средой достигает только 10 градусов. Нагрев стимулирует активность насекомых. В это же время раскрываются пыльники и осыпают насекомых пыльцой сверху. Щетинки усыхают и опылители, вымазанные пыльцой, оказываются на свободе.

Термогенные эпизоды распределены в течение суток так, чтобы начало первого у одних растений популяции совпадает с освобождением насекомых после второго у других.

Как оказалось, в предшествующий цветению день в стерильном верхнем придатке идет накопление салициловой кислоты, которое начинается в 12 и достигает максимума в 17 часов. Концентрация салицилата повышается в 100 раз. В середине ночи уровень салицилата повышается также и в нижней части початка. После термогенеза уровень салицилата возвращается к исходному (около 10-15 mmol).

Термогенез можно вызвать и во "внеурочное" время. Изолированный придаток початка сохраняет чувствительность к экзогенной салициловой кислоте и отвечает повышением температуры. Интересно, что в темноте для индукции термогенеза необходимо добавить больше салицилата, чем на свету. (По-видимому, Sauromatum не склонен к термогенезу, пока соцветие находится в почве и не доступно для опылителей).

По-видимому, салициловая кислота активизирует геном и запускает синтез м-РНК для альтернативной оксидазы, а вскоре в термогенных тканях накапливается и сам белок (между воздействием салицилата и повышением температуры проходит несколько часов). Кроме того, под действием салициловой кислоты в придатке повышается содержание летучих веществ, привлекающих насекомых.

Вряд ли салициловая кислота является непосредственным триггером потока электронов с цитохромоксидазного на альтернативный путь, поскольку повышение ее уровня зарегистрировано не у всех термогенных видов растений. Например, при развитии стробила Cycas (голосеменные), цветка Victoria regia или соцветия у пальм температура также может повышаться за счет работы альтернативной оксидазы, однако у этих растений термогенез не связан с повышением уровня салицилата.

Повышенный уровень салицилата в листьях риса (Oryza sativa) не свидетельствует о том, что рис способен к термогенезу. Таким образом, регуляция термогенеза салициловой кислотой относится к частной физиологии семейства ароидных и некоторых других растений. (Например, у видов ряски добавление салициловой кислоты стимулирует цветение).

Уровень салициловой кислоты возрастает в ответ на внедрение патогенов. Впервые это было показано при инфицировании табака вирусом табачной мозаики в 1990 г. Устойчивость к вирусу можно было повысить, обрабатывая растения салициловой кислотой. Интересно, что даже при простом механическом повреждении активизируется начальный фермент биосинтеза салицилата - ФАЛ (см. выше). Если растение не может синтезировать салицилат (например, в результате блокирования гена ФАЛ или гена гидроксилазы бензойной кислоты), у него снижается иммунная реакция ко многим патогенам.

В ответ на обработку растений салициловой кислотой начинается синтез PR-белков (pathogenesis related proteins). Их делят на несколько классов. Белки PR-1 класса отвечают за проявление системной устойчивости (т.е. устойчивости во всем растении далеко от непосредственного места контакта с патогеном). PR-1 белки токсичны для многих грибов, хотя механизм токсического действия пока еще не достаточно изучен. PR-2 белки оказались b-1,3-глюканазами, расщепляющими глюканы клеточной стенки растений и некоторых грибов на более короткие фрагменты. Фрагменты глюканов также способны вызывать иммунную реакцию растительных клеток. PR-3 класс белков - хитиназы, которые расщепляют хитин клеточных стенок грибов. Появление низкомолекулярных продуктов деградации хитина является сигналом о том, что в место повреждения попали гифы гриба. К PR-4 классу относят гевеин-подобные белки, которые отвечают за "склеивание" латекса при повреждениях. Заметим, что эти физиологические ответы частично перекрываются с ответами на этилен и жасминовую кислоту.

Салициловая кислота вызывает синтез ФАЛ, и тем самым усиливает собственный биосинтез. Кроме того, салициловая кислота можент связываться с некоторыми Fe-содержащими белками (например, с каталазой). При взаимодействии с салицилатом активность каталазы падает, концентрация перекиси водорода и других активных форм кислорода растет. К этому же эффекту приводит взаимодействие салицилата с аскорбат-оксидазой. Повышение концентрации активных форм кислорода стимулирует образование новых порций салициловой кислоты, что приводит к усилению эффекта. В крайнем выражении обработка салициловой кислотой может вызвать гибель клеток (запускается реакции сверхчувствительности).

Таким образом, салицилат, в отличие от других гормонов, не только регулирует процессы через соответствующие рецепторные системы, но и непосредственно участвует в аллостерической регуляции работы ряда ферментов. Т.е. для развития физиологического ответа необходима более высокая концентрация салицилата (до 10^-3 - 10^-5 моль/л). Такие высокие концентрации не характерны для "типичных" гомонов, поэтому часто дискутируют о том, стоит ли салициловую кислоту включать в список растительных гормонов.

Олигосахарины.

Роль коротких углеводных молекул - олигосахаридов - в регуляции физиологических процессов у растений обсуждают с конца 1980-х годов, когда было обнаружено, что продукты деградации клеточной стенки паразитического гриба фитофторы могут вызвать специфичную иммунную реакцию у растений. Даже небольших перестроек углеводного скелета было достаточно, чтобы этот эффект исчез. Таким образом, среди олигосахаридов большинство не обладало активностью в проведенных тестах. Те олигосахариды, которые вызывали физиологический эффект, были названы олигосахаринами.

Таким образом, каждый олигосахарин является олигосахаридом, однако не каждый олигосахарид - олигосахарин.

Олигосахарины образуются как продукты расщепления полисахаридов клеточной стенки. Фактором, вызывающим расщепление, могут быть как собственные ферменты растительных клеток, так и ферменты грибов или бактерий. В состав олигосахаринов могут входить ксилоза, рамноза, галактоза. Кроме того, к олигосахаринам часто относят продукты деградации пектина, содержащие остатки уроновых кислот. Иногда в состав олигосахаринов входит многоатомный спирт инозит, остаток которого происходит из гликолипидов мембран. Короткие фрагменты хитина, образующиеся под действием растительных хитиназ при грибной инфекции также являются олигосахаринами, хотя они происходят из чужеродного объекта.

Было обнаружено, что олигосахаридная фракция суспензионной культуры клена стимулирует деления клеток у многих объектов в культуре in vitro, что говорит о том, что в экстрактах присутствуют олигосахарины.

Еще один физиологический эффект, в котором участвуют фрагменты клеточной стенки растений - созревание плодов. При этом ферменты, разрушающие разнообразные гликаны клеточной стенки, высвобождают активные олигосахарины, которые способны стимулировать дальнейшее созревание. При созревании плодов важную роль играют пектолитические ферменты и образующиеся фрагменты пектина.

Специфические олигосахарины используются как сигнальные молекулы при узнавании симбионтов в системе Rhizobium - растение-хозяин. Без обмена олигосахаринами клубеньки бобовых растений не образуются.

Короткие пептиды.

В настоящее время выделены и охарактеризованы некоторые короткие пептиды, которые играют важную сигнальную функцию у растений. Как правило, они синтезируются в клетках в виде более крупныз белков-предшественников, а затем в результате протеолитических реакций происходит "созревание" коротких пептидов. Они выходят из клетки в апопласт и оказывают физиологическое действие на другие клетки.

Один из первых коротких пептидов с сигнальной функцией был выделен из томатов. Он отвечал за системный ответ на механическое повреждение и проникновение патогенов в растение: индуцировал синтез ингибиторов протеиназ и фитоалексинов. В результате иммунный ответ наблюдается не только в месте повреждения, но и все растение в целом становится устойчивым к инфекции (системная устойчивость). Отвечающий за системную устойчивость короткий пептид, содержащий 18 аминокислот, был назван системином. Контроль за биосинтезом системина осуществляет жасминовая кислота. Системин синтезируется сначала в виде предшественника длиной в 200 аминокислотных остатков. У томатов был также обнаружен рецептор, связывающийся с системином - белок размером 160 кДа. Системин оказался специфическим для томатов и картофеля, но не вызывал системного ответа у табака. В дальнейшем из табака был выделен системин, не похожий на томатный.

Из суспензионной культуры аспарагуса был выделен еще более короткий пептид (всего 4-5 аминокислот), в состав которого входил сульфатированный тирозин. Добавление этого пептида вызывало увеличение скорости деления клеток in vitro, повышало митотический индекс. Этот пептид был назван фитосульфокином. Фитосульфокин обнаруживается в местах активного деления клеток, способствуя органогенезу (образованию листьев, боковых корней и т.д.). Фитосульфокин, по-видимому, достаточно универсальный короткий пептид - он вызывал деление клеток не только у аспарагуса, но и у риса и других не родственных растений.

Другие обнаруженные короткие пептиды регулируют достаточно специфичные функции в растениях. Так, пептид CLAVATA 3, содержащий 78 аминокислот, синтезируется в верхних слоях центральной зоны меристемы (делящихся клетках). Он необходим для регуляции размера апикальной меристемы побега у арабидопсис. Пептид CLAVATA 3 связывается с белком-рецептором CLAVATA 1, причем рецептор сосредоточен в покоящемся центре меристемы.

Короткий пептид CLAVATA 3 служит сигналом о количестве делящихся клеток в центральной зоне меристемы: высокая концентрация "говорит" покоящемуся центру о том, что делящихся клеток много, а низкая - что их мало. Покоящийся центр играет важную регуляторную роль, посылая обратно наверх сигнальные молекулы, стимулирующие (или ингибирующие) клеточные деления.

Интенсивное взаимодействие короткого пептида CLAVATA 3 с CLAVATA 1 означает, что число делящихся клеток чрезмерно велико, и из покоящегося центра в центральную зону меристемы направляется сигнал, уменьшающий число делящихся клеток. Вместе с этим падает и концентрация короткого пептида CLAVATA 3, а это в свою очередь приводит к тому, что покоящийся центр стимулирует деления клеток в центральной зоне. Описанный механизм обратной связи с участием CLAVATA 3 и его рецептора CLAVATA 1 поддерживает объем меристемы на определенном уровне. При мутации как в гене рецептора (clv1), так и в гене короткого пептида (clv3), меристема становится очень крупной (число клеток может оказаться в 1000 раз больше, чем у дикого типа). Это приводит к фасциации - стебель становится плоским, расположение листьев нарушается.

Короткий пептид SCR из 53-57 аминокислот выделяется прорастающим пыльцевым зерном у капусты. Для каждой линии капусты характерен свой особый вариант SCR-пептида. Рецепторы к SCR-пептиду находится в тканях рыльца, и при узнавании развитие пыльцевой трубки останавливается. Таким способом капуста избегает самоопыления.