АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА - СИГНАЛ ВОДНОГО СТРЕССА.

 

Еще в 1949 году были проведены эксперименты по изучению покоящихся почек ясеня. Водный экстракт обладал свойством замедлять рост гипокотилей, а при нанесении совместно с ауксинами эктракт покоящихся почек ингибировал действие ауксинов. Когда покой почек заканчивался, экстракт больше не обладал угнетающим рост действием. Тогда исследователи предположили, что в почках содержится особое вещество - дормин (от английского dormancy - покой).

В 1962-64 годах в Соединенных Штатах Лью и Карес работали над проблемой созревания и опадения коробочек хлопчатника. Они предположили, что в созревающих коробочках хлопчатника накапливается вещество, стимулирующие обезвоживание плода, его растрескивание и формирование отделительного слоя. Гипотетический гормон назвали абсцизином (от abscisio - опадение). В 1965 году абсцизин был выделен и охарактеризован. При этом выяснилось, что абсцизин и дормин - одно и то же соединение. Из-за приоритета за гормоном установилось название, данное Лью и Каресом - абсцизовая кислота (АБК). Заметим, что абсцизовая кислота редко регулирует процессы опадения органов (обычно за это отвечает этилен). Она нужна для введения растения в состояние покоя, поэтому название "дормин" гораздо лучше отражало бы суть регулируемых процессов.

Биосинтез абсцизовой кислоты.

При исследовании химической природы АБК оказалась изопреноидным соединением. Она содержит 15 атомов углерода, которые соединены в характерные изопреновые С₅-звенья. Обычно изопреноиды синтезируются в пластидах из общего предшественника - дезоксиксилозо-5-фосфата. Далее это соединение превращается в изопентенилпирофосфат - универсальный блок терпеноидного метаболизма.

В ранних работах было высказано предположение, что АБК синтезируется как одно из ответвлений изопреноидного метаболизма после конденсации трех С₅-звеньев. Т.о., эта гипотеза предполагает прямой синтез АБК из более простых предшественников. В последствии оказалось, что прямой синтез АБК характерен только для фитопатогенных грибов (например, для возбудителя серой гнили - Botrytis).

Гипотеза прямого синтеза доминировала в физиологии растений до начала 1990-х годов, пока не появились данные, что мутации, повреждающие биосинтез каротиноидов у растений, одновременно нарушают биосинтез АБК. Оказалось, что у высших растений АБК синтезируется через более сложные предшественники. Т.о., можно рассматривать АБК как продукт специфической деградации каротиноидов.

Первые этапы биосинтеза АБК связаны с виолаксантиновым циклом. Зеаксантин через промежуточный продукт - антераксантин - превращается в все-транс-виолаксантин. Дальнейшие превращения включают 9-цис-изомеризацию каротиноидного предшественника (на эту роль претендуют виолаксантин и неоксантин). В конечном итоге 9-цис-предшественник расщепляется на два неравных фрагмента: С₁₅ (ксантоксин) и С₂₅. С₂₅-фрагмент быстро деградирует, а ксантоксин превращается в абсцизовый альдегид.

Для последнего этапа биосинтеза необходим молибден-содержащий белок, который катализирует превращение абсцизового альдегида в АБК. Примечательно, что молибденовый кофактор у этого фермента общий с нитрат-редуктазой и ксантин-дегидрогеназой. При мутациях, затрагивающих синтез молибденового кофактора, наблюдается плейотропный эффект: растение не может восстанавливать нитрат и не способно конвертировать абсцизовый альдегид в кислоту (рис.7.20).

В настоящее время у разных растительных объектов получены мутации, затрагивающие тот или иной этап биосинтеза АБК.

 Передача АБК-сигнала.

До сих пор белки-рецепторы АБК не охарактеризованы в достаточной мере. Один из претендентов на эту роль - белок RPK 1 (receptor-like protein kinase). Он является трансмембранным, связывается с АБК и содержит протеинкиназный цитоплазматический домен.

Известны некоторые из компонентов системы трансдукции АБК-сигнала. Так, сразу после воздействия абсцизовой кислотой в замыкающих клетках устьиц из НАД⁺ синтезируется циклическая АДФ-рибоза. Этот мессенждер может активизировать Са²⁺-каналы тонопласта, ионы кальция поступают в цитоплазму из вакуолей и других внутриклеточных депо и рН цитозоля увеличивается. Все это приводит к активизации протеин-фосфатаз ABI 1 и ABI 2. Их роль заключается в дефосфорилировании гипотетического белка-репрессора АБК-сигнала. Пока репрессор фосфорилирован, он не дает проявляться дальнейшим ответам на АБК. Дефосфорилирование инактивирует репрессор, и клетка отвечает на АБК. Если протеин-фосфатазы не активны, репрессор постоянно подавляет ответ на АБК и растение становится нечувствительным к этому гормону - ABA-insensitive (abi). Мутации Arabidopsis по протеин-фосфатазам были сначала идентифицированы как нечувствительные к АБК, поэтому соответствующие гены были названы ABI 1 и ABI 2.

Предполагают, что важную позитивную роль в развитии дальнейшего ответа на АБК играют Са²⁺-волны, которые распространяются по клетке с интервалом около 1-2 минут. Специфика ответа на АБК у замыкающих клеток устьиц заключается в том, что на плазмалемме открываются быстрые К⁺-каналы и медленные анионные каналы, через которые происходит отток калия, хлорида и малата. В результате клетка быстро теряет ионы, понижается осмотическое давление в цитоплазме, выходит вода и теряется тургор. Устьичная щель закрывается. Заметим, что закрывание устьиц в ответ на АБК - очень быстрая реакция, при которой механизмы геномной регуляции не успевают включиться.

Для процессов активизации/инактивации генов в ядре важным регулятором является белок ABI 3 (или его гомолог у кукурузы - VP 1). В аминокислотной последовательности обнаружены ДНК-связывающие участки, которые характерны для транскрипционных активаторов. Без ABI 3 или VP 1 не могут экспрессироваться гены созревания эмбриона (EM-гены от embryo maturation), не запускается биосинтез антоцианов, не накапливаются запасные белки в семенах и т.д. В соотвтетствующих промоторах найден достаточно консервативный мотив, который называют АБК-регулируемой последовательностью (ABRC).

Впрочем, одного белка ABI 3 или VP 1 недостаточно для активации транскрипции через ABRC-мотив. Для этого необходим довольно сложный транскрипционный комплекс, в который могут входить, например, EMB-белки (димерные транскрипционные факторы типа "лейциновой зестежки").

Повреждение белков ABI 3 или VP 1 в результате мутации ведет к нарушению процессов формирования зрелого семени и преждевременному прорастанию.

АБК-гормон осмотического стресса.

Абсцизовая кислота появляется в клетке в ответ на изменение состояния воды. В обычных условиях это изменение вызывается тремя факторами:

1. Подсушиванием.
2. Повышением концентрации веществ в клетке.
3. Охлаждением.

Во всех трех случаях вода оказывается для клетки менее доступной, т.е. наблюдается водный дефицит.

Для нормальной жизнедеятельности все молекулы клетки должны находится в определннных условиях оводнения. Белки и нуклиновые кислоты удерживают воду с помощю водородных связей. Кроме того в клетке поддерживается определенная ионная сила, которая также важна для поддержания конформации белков и нуклиновых кислот.

Нехватка воды и повышениие концентрации ионов могут привести к денатурации биологически активных молекул. При повторном увлажнении вернуть им активность сложно. Поэтому клетка должна принять меры, чтобы ДНК, РНК и белки сохраняли свою структуру (конформацию). Этим и обусловленны эффекты АБК на клеточном уровне.

В клетке повышается конценрация осмотически активных веществ. В ответ на абсцизовую кислоту повышается уровень аминокислоты оксипролина, сахарозы и других низкомолекулярных веществ. Осмотическое давление увеличивается, а это препятствует потере воды. Если в окружающей среде есть вода, она начинает активнее поступать в клетку. Кроме этого в клетках появляется небольшой белок, способный образовать особенно много водородных связей с водой. Известно, что вода из водяных "шуб", в которые одеты макромолекулы, испаряется очень неохотно. Маленький белок названн осмотином. В клетках можно увидеть даже появление гранул, состоящих из этого белка.

В ответ на АБК в клетке синтезируются полиамины (спермидин, путресцин). Эти вещества обладают положительным зарядом за счет протонированных атомов азота. Молекулы ДНК и РНК заряженны отрицательно, поэтому они легко ассоциируются с молекулами полиаминов. Комплексы нуклиновых кислот с полиаминами более устойчивы как к изменению ионной силы, так и к обезвоживанию. Синтез новых ДНК и РНК под действием АБК прекращается, клетка переходит в состояние покоя.

Не менее вреден для растительной клетки холод. Вода начинает кристаллизоваться, нарушая структуру мембран. Поэтому главная задача клетки при охлаждении - не допустить кристаллизации воды. Кроме того, существует эффект вымораживания солей: вещества растворенные в воде не включаются в состав кристалов льда, и в незамерзшей части раствора их концентрация повышается, т.е. увеличивается ионная сила (как при засухе). Похожие проблемы вызывают похожие "ответные действия" на стресс: останавливается синтез белков, ДНК и РНК, накапливаются полиамины, оксипролин, сахара и осмотин. Сахара и осмотин припятствуют образованию кристаллов льда в переохлажденной клетке: твердая вода становится аморфной, лед не повреждает мембраны. Биосинтез окрашенных соединений - антоцианов - также зависит от уровня АБК в растениях. При понижении температуры уровень АБК повышается, растения приобретают красную или фиолетовую окраску, хотя физиологический смысл этой реакции оастется не понятным.

Мутантные растения с нарушенным синтезом АБК, быстро гибнут при легкой засухе и при слабых заморзках. Хотя все защитные механизмы имеются, они не включаются без абсцизовой кислоты. Если перед неблагоприятным воздействием в мутантное растение ввести АБК, его устойчивость повышается.

Что бы бороться с водным дифицитом, нужно прежде всего закрыть устьица. Действительно, АБК в течении 10-15 минут закрывает устичные щели у самых различных растений. Водный диффицит может наблюдаться не в листе а в корнях. Тогда корень подает сигнал через АБК и устьица закрываются. В сильную засуху растение сбрасывает старые (нижние) листья, стремясь избавится от лишней испаряющей поверхности. Только в этом случае АБК отвечает за листопад. Повторим, что осенний листопад у растений умеренных широт находится под контролем этилена.

При водном дефиците должны остановиться процессы роста (ведь на 95-98 % органы растений состоят из воды). Действительно, АБК угнетает растяжение клеток, вызванное ауксином и приостанавливает транспорт самого ауксина.

Абсцизины могут появляться в ответ на увеличение концентрации некоторых веществ снаружи от клетки. Это могут быть сахара, которые образуются в листьях активно растущих веток. Действительно, в молодых ветках яблони содержание АБК повышенно. Ветка в середине лета впадает в состояние физиологического покоя, мы не наблюдаем видимого роста (т.е. растяжения клеток под действием ауксина или гибберелина). Но клеточные деления все равно происходят. Меристемы продолжают работать. В результате на насыщенном АБК побеге развиваются почки - побеги будущего года. Из физиологического покоя растение сложно вывести внешними факторами. Высокий уровень АБК не дает транспортироваться ауксинам из апикальной почки, поэтому нет апикального доминирования: боковые почки развиваются в пазухах всех листьев.

АБК продолжает действовать на почки в течении всего лета. Заканчивается ее действие у разных растений в разное время. У деревьев умеренной зоны действие АБК прекращается в зимние месяцы. У конского каштана действие АБК прекращается осенью, поэтому в теплую осень почки, освободившиеся от абсцизинов, открываются и деревья повторно цветут. У других растений высокое содержание АБК держится до заморзков, а то и до января-февраля. Только тогда АБК может начать разрушаться.

Разрушению АБК препятствует низкая температура воздуха. Физиологи говорят, что наступила фаза вынужденного покоя. Вынуждают покоится растение неблагоприятные внешние факторы (низкая температура или недостаток воды). Как только их действие ослабеет, АБК разрушается и начинается видимый рост. Поэтому во второй половине зимы почки охотно распускаются если перенести растения в теплое помещение.

Регуляция покоя семян АБК.

Самый глубокий физиологический покой - это покой семян, который может прдолжаться десятками лет. В начале развития зародыш посылает сигналы от стеблевого и корневого апексов (ауксины и цитокинины) в плод и далее по всему растению, для того что бы обеспечить себя питательными веществами и быстро расти. Но когда окончательный размер зародыша достигнут и начинается синтез АБК. В некоторых случаях (как у кукурузы) этот синтез может быть вызван сахарозой, которую крупный зародыш аттрагировал в большом количестве. АБК через белки VP 1 (ABI 3) активизирует синтез белков эмбринального созревания - EM (embryo maturation) или LEC 1 (leafy cotyledon), которые регулируют дальнейшие процессы переходя в состояние покоя.

Абсцизовая кислота вызывает синтез крахмала в эндосперме и запасного белка - алейроновых гранул в алейроновом слое. "По совместительству" запасной белок обладает функцией осмотина: он хорошо удерживает воду. ДНК и РНК упаковываются в белки и полиамины (спермидин - полиамин, впервые выделенный из семян), рост прекращается и начинается обезвоживание. Зародыш теряет воду, и вместо обычных 95-97% она составляет 14% и менее от общей массы зародыша. Если плод сухой то вместе с зародышем усыхает и он. В створках вскрывающихся плодов заранее закладываются механически ослабленные слои клеток, так что при потере воды эти слои лопаются и плод вскрывается. Именно этот процесс и изучали первооткрыватели АБК.

Если плод сочный, и семена внутри него уже подсушились, настает черед этилена: плод делается мягкими опадает.

Глубина подсушивания семян и концентрация АБК, накопленной в них, у разных видов различаются. Так, семена лесных растений (пролески, хохлатки, подснежники, галантусы и др.) практически не обезвожены и не приспособлены к сильному подсушиванию. Накопленная АБК действует в течении всего лета и часто осени, мешая им прорастать.

У степных и пустынных растений (ковылей, тюльпанов, оносмы) семена усыхают очень сильно, а АБК разрушается лишь после сезона дождей и зимней прохлады. Особенно много АБК накапливается в зрелых семенах пионов, боярышника, волчего лыка. Что бы запустить процессы ее разрушения приходится дважды охлаждать семена. Для надежного получения всходов рекомендуется собирать слегка недозрелые семена - содержание АБК у них ниже, чем у полностью созревших.

Некоторые растения "удаляют" АБК из семян с помощью весенних талых вод. Чтобы прорастить такие семена достаточно промыть их проточной водой.

У большинства культурных растений (горох, пшеница, рожь) период действия АБК очень краткий и достаточно предоставить зародышу влагу, как АБК разрушится, и семя пойдет в рост. Особенно неприятно это явление в сезон осенних дождей, когда на промокших колосьях (или в бобах) начинается прорастание семян.

Синдром дифицита АБК.

Абсцизовая кислота - важный гормон в жизни растений, хотя он не является необходимым. В отсутствии ауксина или цитокинина растение ждет неминуемая смерть, а в отсутствии АБК при хороших условиях можно спокойно жить. Конечно, если настанет засуха или мороз, без АБК обойтись нельзя. Этим свойством и пользуются ученые , чтобы обнаружить мутантов с нарушенным биосинтезом АБК. После мутагенеза высаживают потомков, среди которых попадаются самые разнообразные мутации. Делянку не поливают и ждут, какие растения подвянут первыми. (Обычно без АБК растение не может закрыть устьица и завядает при малейшей засухе). Эти экземпляры помечают, отсаживают и "отпаивают" водой. До образования семян мутанты ничем не отличаются от нормальных растений. Но семена никак не хотят накапливать питательные вещества, не впадают в состояние покоя и прорастают тут же, еще в плоде. Такое явление получило название вивипарии (буквально - живорождение). Семена нужно немедленно снимать с материнского растения и выращивать дальше.

У кукурузы мутации с таким фенотипом называют vp (от viviparous). Например, ген VP 8 отвечает за превращение АБАльдегида в АБК, а ген VP 1 - за передачу сигнала от АБК на уровне транскрипции.

АБК и форма листьев.

Многие водные растения после того, как достигнут поверхности воды развивают листья принципиально отличные от водных. Подводные листья довольно тонкие, со слабо развитой механической тканью, без устьиц. Газообмен с водной фазой происходит по всей поверхности листа - он обычно не покрыт восковым слоем кутикулы. Оказавшись в воздушной среде, подводный лист гибнет.

Надводные листья более прочные, покрыты кутикулой и имеют устьица для газообмена с воздухом. Под водой эти листья не справляются с газообменом, поскольку устьица в этих условиях сжимаются окружающими клетками эпидермиса.

Условия воздушной среды более засушливые, чем условия под водой. Поэтому как только точка роста оказывается над водой в ней повышается содержание АБК. Меристема начинает образовывать надводные листья. Если поместить растение в аквариум с раствором АБК, меристема решит, что ее "вынули" из воды и начнет образовывать воздушные листья.

Более чем 50 видов водных растений с которыми были поставлены аналогичные эксперименты продемонстрировали одинаковый механизм регуляции типа листьев. Из растений средней полосы это стрелолист (Sagittaria), водный лютик (Batrachium), омежник водный (Oenanthe) и др.

Аналогичный механизм регуляции работает при смене генераций листьев у полупустнынных растений. В зависимости от сезона года они развивают либо С-3, либо С-4 листья. Как известно, листья этих типов отличаются анатомически. Изменить анатомию зрелого листа невозможно, поэтому при засухе наблюдается листопад С-3 листьев, а на смену им развиваются более приспособленные к водному дефициту С-4 листья. Сигналом для листопада С-3 листьев и для формирования С-4 листьев служит АБК.

У луковичных растений АБК по-разному действует на подземную и надземную часть листа. У лука обработка АБК вызывает перестройку цитоскелета в клетках подземной части: вместо продольного расположения кортикальных микротрубочек наблюдается поперечное. Клетки перестают расти в длину и начинают утолщаться, запасают сахара (концентрация сахаров может достигать 7-10% от сырой массы!). Надземная часть листа, напротив, увядает, вещества из нее перемещаются в соответствующую чешую. Луковица переходит в состояние покоя, вызванного засухой.