ЭТИЛЕН - СИГНАЛ МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА.

Открытие физиологической роли этилена.

В 1901 году Дмитрий Николаевич Нелюбов выращивал горох в лаборатории, в Санкт-Петербурге, но семена давали искривленные, укороченные проростки, у которых верхушка была согнута крючком и не разгибалась. В теплице и на свежем воздухе проростки были ровные, рослые, и верхушка на свету быстро распрямляла крючок. Нелюбов предположил, что фактор, вызывающий физиологический эффект, находится в воздухе лаборатории.

В то время помещения освещали газом. В уличных фонарях горел тот же газ, и давно было замечено, что при аварии в газопроводе стоящие рядом с местом утечки газа деревья преждевременно желтеют и сбрасывают листья.
Осветительный газ содержал разнообразные органические вещества. Чтобы удалить примесь газа, Нелюбов пропускал его через разогретую трубку с оксидом меди. В "очищенном" воздухе проростки гороха развивались нормально. Для того, что бы выяснить, какое именно вещество вызывает ответ проростков, Нелюбов добавлял различные компоненты светильного газа по очереди, и обнаружил, что добавка этилена вызывает:

1) замедление роста в длину и утолщение проростка,
2) "не разгибающуюся" апикальную петельку,
3) изменение ориентации проростка в пространстве

Эта физиологическая реакция проростков была названа тройным ответом на этилен. Горох оказался настолько чувствительным к этилену, что его стали использовать в биотестах для определения низких концентраций этого газа. Вскоре было обнаружено, что этилен вызывает и другие эффекты: листопад, созревание плодов и т.д. Оказалось, что этилен способны синтезировать сами растения, т.е. этилен является фитогормоном.

 Биосинтез этилена.

Синтез этилена в растениях начинается с аминокислоты метионина.Взаимодействуя с АТФ, образуется S-аденозилметионин. (Этот интермедиат используется не только в биосинтезе этилена, но и при синтезе полиаминов и др. соединений. Обычно S-аденозилметионин является донором метильных группировок).

S-аденозилметионин превращается в 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АЦК) с помощью АЦК-синтазы. АЦК можно рассматривать как неактивную транспортную форму этилена, а количество образовавшегося этилена зависит от экспрессии гена АЦК-синтазы.

Циклопропановая группировка является напряженной (между атомами углерода нехарактерный угол в 60°). Тем не менее разрушение АЦК с образованием этилена - ферментативный процесс.

После образования этилен может окисляться в растительных клетках, что, по-видимому, необходимо для модуляции действия этого фитогормона. Однако процесс окисления этилена слабо изучен.

 Рецепция и передача сигнала.

У Arabidopsis обнаружено небольшое генное семейство белков-рецепторов этиленового сигнала. По фенотипическому проявлению гены были названы ETR1, ETR2(ethylene-resistant), EIN4 (ethylene-insensitive), ERS1 и ERS2. Белки-рецепторы оказались высоко гидрофобными, т.е. они входят в состав мембран. Для связывания молекулы этилена необходим атом меди, который входит в состав рецепторного белка. Кроме того, рецепторы этилена оказались родственными двухкомпонентным гистидин-киназам и участвуют как в процессе атофосфорилирования так и в фосфорилировании других белков.

Рецепторный белок находится в комлексе с серин/треонин-киназой CTR1. Ближайшим мессенждером является мембранный белок EIN2 с пока еще не выясненной функцией. В каскаде усиления участвуют MAP-киназы и некоторые транскрипционные факторы (например, EIN3).

В отличие от других гормонов, при рецепции этилена использует механизм негативной регуляции. В отсутствие этилена рецепторный белковый комплекс находится в активном состоянии. При этом физиологический ответ на этилен подавляется. При связывании этилена рецептор переходит в неактивное состояние, ответ оказывается "разрешенным".

Пути восприятия этилена в растении продублированы несколькими рецепторами, поэтому получить полностью нечувствительные к нему растения достаточно трудно. Для этого необходимо, чтобы растение оказалось мутантным по 4-5 генным локусам одновременно.

Этилен как гормон механического стресса.

Выделение этилена тесно связано с механическим воздействием на клетки растений. Возьмем пример ответа проростка гороха, который наблюдал Нелюбов. Пока росток не достиг поверхности, нужно защищать нежные клетки верхушечной меристемы от повреждения. Поэтому происходит изгиб и образование апикальной петельки. Сквозь почву растет не меристема, а более прочный нижележащий участок.

Когда на пути проростка появляется механическое препятствие (камень), проросток выделяет больше этилена, рост в длину приостанавливается и начинается утолщение. Проросток стремится преодолеть препятствие, усилив давление. Если это удалось, концентрация этилена падает и рост в длину восстанавливается. Но если препятствие слишком крупное, то продукция этилена еще больше усиливается. Проросток отклоняется от вертикали и огибает камешек.

В воздушной среде концентрация этилена падает, проростки разгибают апикальную меристему и начинается развитие листьев.

 Этилен и прикосновение.

Вплоть до 1991 года у физиологов растений были достаточно отрывочные представления о том, как именно растения чувствуют прикосновение. Методом вычитания с-ДНК-библиотек было установлено, что опрыскивание растений Arabidopsis thaliana водой вызывает синтез новых матричных РНК - через 10-15 минут их уровень поднимался в сотни раз.

Опрыскивание является комплексным фактором: изменяется влажность воздуха, создается тень от водяных паров, и, наконец, листья подвергаются механической нагрузке. Каждый из факторов был исследован по отдельности.

Выяснилось, что влажность не играет никакой роли, но если растение потереть стеклянной палочкой, оно почувствует это и через 10-15 минут ответит экспрессией новых м-РНК. Обнаруженные гены были обозначены как TCH1, TCH2, TCH3, TCH4, TCH5 (от английского touch - прикосновение).
Если не прикасаясь к растению внезапно накрыть его черным колпаком, то в нем также повышается уровень TCH-матриц. Создание достаточно мощных звуковых эффектов не привело к желаемому результату : матричные РНК TCH в составе клеток не появились.

За что же отвечают гены, продукты которых появляются в клетках при прикосновении? Они оказались очень похожи на известные кальций-связывающие белки - кальмодулины. Эти белки вместе с Са²⁺ активизируют работу цитоскелета и способствуют переходу из золя в гель многих структур в растительной клетке. Растения, которые часто беспокоили стеклянной палочкой, заметно отстают в росте от тех к которым не прикасались, однако оказываются механически более прочными, закаленными.

Белковый продукт гена TCH 4 оказался ксилоглюкан-эндотрансгликозилазой. Синтез этого белка можно вызвать также брассиностероидами (см. ниже).

Те же эффекты можно вызвать добавлением этилена. При этом также происходит синтез Са-связывающих TCH-белков.

Этилен и заживление ран.

Многие растения образуют млечники, которые содержат латекс (натуральный каучук). Однако каучук не "застывает" внутри млечников (как и не сворачивается кровь в сосудах). Но стоит растение повредить, на поверхность выступает латекс, который быстро твердеет и закупоривает место повреждения. Латекс склеивает споры грибов и бактерий, застывает в ротовом аппарате насекомых или приклеивает их к капельке выступившего каучука.

О том, что заставляет латекс быстро твердеть при повреждении растения, долгое время ничего не знали бы, если бы не запросы сельского хозяйства. На плантациях гевеи затвердение латекса - вредный процесс: приходится заново делать насечки на стволах деревьев, подставлять сосуды для сбора каучука в новые места, что создает массу лишней работы.

Оказалось, что латекс застывает под действием этилена. Важную роль при этом играет минорный белок латекса - гевеин. С застыванием латекса можно до некоторой степени бороться, обрабатывая растения ингибиторами синтеза этилена. (Наиболее известный ингибитор - ионы серебра, но есть и более дешевые). Таким образом, у растений-каучуконосов этилен способствует заживлению механических повреждений.

Кроме того, под действием этилена активизируется особая ткань раневая перидерма. Образуется пробковый камбий, который образует слой суберинизированной пробки, отделяющей здоровую (живую) ткань от больной (мертвой). Пробка высоко гидрофобна, что позволяет эффективно пресечь распространение грибов и бактерий, попавших в рану, предохраняет здоровую ткань от чрезмерного испарения.

Размеры и место образования раневой перидермы отличаются у разных растений. Так медуница образует раневую перидерму в нескольких миллиметрах от зоны повреждения (например, грибами). Участок листа, окруженный раневой перидермой, выпадает.

У фасоли активизируется раневая перидерма в основании листовой пластинки, и растение жертвует поврежденной частью сложного листа во имя безопасности целого растения.

Казалось бы, раневая перидерма может быть полезна лишь при нападении бактерий и грибов. Однако и при нападении насекомых и клещей она играет немаловажную роль. Под действием этилена происходит локальный "листопад" - поврежденный лист опадает на землю вместе с вредителем. Шансов вновь добраться до кроны у вредителей меньше. Защитный "листопад" наблюдается, например, у роз при нападении паутинного клеща.

Регуляция листопада в умеренных широтах.

Этилен регулирует явление листопада. Эта реакция настолько впечатлила физиологов растений, что этилен иногда считают гормоном старения растений. Явление листопада - это не просто старение. Так, в тропиках отдельные листья живут 3-4 года (часто больше). Сокращение сроков жизни листа связано с защитной реакцией на механический стресс.

При опадании листьев образуется очень много открытых ранок в местах прикрепления. Чтобы лист отделился без вреда для целого растения, в его основании формируется отделительный слой. Его работа практически идентична работе раневой перидермы. Место будущего повреждения закрывается пробкой, вышележащая ткань разрыхляется и становится непрочной, лист опадает. Что бы разрыхлить клеточную стенку, в нее выделяются пектиназы. При расщеплении пектина высвобождаются физиологически активные вещества - олигосахарины (см. далее), которые стимулируют дальнейшее размягчение клеточных стенок.

Листья, которые готовятся к листопаду, передают соединения азота и углеводы другим частям растения. Хлорофилл разрушается, и лист желтеет. В тканях накапливаются вредные вещества, которые будут удалены из растения листопадом.

Таким образом явления листопада и защиты от повреждений тесно связаны. В случае листопада в умеренных широтах мы видим опережающую физиологическую реакцию. Зимой листья повреждаются морозом, на них падает снег, вызывая усиление механической нагрузки на ветки. Растение как бы "предусматривает" будущий механический стресс и заранее освобождается от листьев. Поэтому, не удивительно, что все процессы, связанные с потерей листьев в районах с холодной и снежной зимой, находятся под контролем этилена.

Формирование и созревание плодов.

Начало жизни плода лежит еще в цветке, точнее в завязи. На поверхности рыльца попадают пыльцевые зерна, они начинают прорастать и механически давят на проводниковую ткань столбика, что бы достичь семязачатков, спрятанных в глубине пестика. Естественно, что при прорастании пыльцы ткани столбика начинают выделять этилен.

Разные части цветка по-разному отвечают на сигнал этилена. Так, все органы, привлекавшие насекомых-опылителей либо отмирают, либо меняют окраску. В считанные часы после опыления лепестки ипомеи теряют тургор и увядают. У листочков околоцветника лилии в основании активизируется отделительный слой, и они опадают (сравните с явлением листопада). У медуницы меняется рН (кислотность) вакуолярного сока и цветки из розовых превращаются в синие. У белокрыльника (Calla palustris) этилен вызывает изменение цвета покрывала соцветия с белого на зеленый. В дальнейшем растение использует покрывало как дополнительный источник фотоассимилятов для развивающихся плодов. (Заметим, что в одних случаях этилен вызывает разрушение хлорофилла, пожелтение и опадание листьев, тогда как в других, способствует усилению фотосинтеза).

Тычинки при действии этилена увядают, а завязи начинают активно расти, привлекая новые питательные вещества.

Особенно важен этилен на последнем этапе созревания сочных плодов. Здесь "играют" практически все рассмотренные эффекты. Плод останавливается в росте (как и проросток наткнувшийся на препятствие), клетки плода начинают выделять в апопласт пектиназы - плоды становятся мягкими. Кроме того, образуются физиологически активные фрагменты пектина - олигосахарины (см. далее). В ножках плодов активизируется отделительный слой и образуется раневая перидерма ( как при листопаде), меняется рН - плоды становятся менее кислыми, а так же меняется их окраска с зеленой на более желтую или красную (как у лепестков некоторых растений).

Заметим, что раньше других созревают и опадают поврежденные плоды. Механический стресс вызывают птицы, личинки насекомых или фитопатогенные грибы. Как в случае листьев, растение стремится отбросить некачественный плод, чтобы остальные плоды оказались по возможности здоровыми.

Созревание плодов под действием этилена - это такая же упреждающая физиологическая реакция, как листопад. Сочные плоды распространяются птицами и млекопитающими, которые повреждают плоды при поедании, и растение заранее продуцирует этилен.

Свойство ускорять созревание плодов было обнаружено у этилена давно, еще в 20-е годы и с тех пор его широко используют. При транспортировке важно, чтобы плоды оставались прочными и зелеными. Для этого их перевозят в проветриваемой таре, оберегая плоды от механических повреждений, вызывающих синтез этилена. Кроме того, биосинтез этилена замедляется при пониженной температуре и при высокой концентрации углекислоты в воздухе. В принципе можно было бы применять и ингибиторы биосинтеза этилена, если бы не их токсичность для человека. Единственное место применения ингибиторов - хранение срезанных цветов. В Голландии цветы ставят не в обычную воду, а в специальный раствор, который помимо минеральных солей, продуктов фотосинтеза и антисептиков содержат ингибиторы синтеза этилена. С помощью таких добавок торговцам удается сохранять букеты свежими в течении многих дней.

Чтобы этилен не образовывался в плодах, получают мутанты с нарушенным биосинтезом этилена. Уже получены сорта томатов, созданные на основе таких мутантов. Эти томаты можно очень долго хранить и перевозить на далекие расстояния. Незадолго до продажи их обрабатывают этиленом и плоды быстро созревают. Однако, такая технология заметно снижает вкусовые качества плодов.

Существует поговорка, что одно гнилое яблоко портит целую бочку. Это действительно так. Гнилое яблоко служит источником этилена, который вызывает размягчение тканей у остальных яблок. Более того, каждый плод начинает вырабатывать свой этилен по мере созревания и в бочке начинается "цепная реакция" производства этилена.

Биотический стресс.

Самый распространенный из механических стрессов вызывают травоядные животные. В ответ на обработку этиленом в листьях многих растений начинается синтез веществ, препятствующих поеданию биомассы.

На Африканском континенте люди решили приручить антилоп, поскольку они более приспособлены к местным условиям, чем европейский скот. Для этого построили загоны вокруг зарослей акации (природный корм антилоп). Однако животные стали погибать в загонах, хотя корма явно хватало. Оказалось, что антилопы гибнут от отравления.

Анализ химического состава листьев акации в загоне показал, что они богаты полимерными фенольными соединениями - таннинами. Таннины ядовиты для антилоп. Акации в естественном месте обитания содержат мало таннинов. Выяснилось, что образование таниннов можно вызвать этиленом. Антилопы повреждают акации, при этом деревья выделяют этилен, а затем происходит синтез ядовитых веществ. Интересно, что этиленовый сигнал передается по воздуху (это и не удивительно - этилен- газообразное вещество). У акаций, которые росли рядом с загоном, также повышалась концентрация этилена "на всякий случай": если соседнее растение повреждено, нужно о себе позаботится заранее.

В природе антилопы часто перемещаются от заросли к заросли, когда таннины накапливаются, антилопы уже пасутся на другом месте.

К другому классу защитных соединений принадлежат ингибиторы протеиназ. Для переваривания белковой пищи необходимы ферменты, разрушающие белки. Наиболее известен компонент желудочного сока - трипсин. Некоторые растения вырабатывают вещества, инактивирующие трипсин и похожие на него ферменты. Под действием механического стресса растения вырабатывают этилен, этилен вызывает синтез ингибиторов протеиназ, эти вещества попадают в желудок теплокровных или насекомых и вызывают сильные нарушения пищеварения.

Под действием этилена растения могут вырабатывать фитогемаглютины. Это название вещества получили за свойство склеивать эритроциты крови. При поедании биомассы фитогеммаглютины попадают в желудок и кишечник, а оттуда всасываются в кровь. Эритроциты слкеиваются, образуются тромбы и происходит закупорка кровеносных сосудов. В высокой дозе фитогеммаглютины смертельны.

Механические повреждения могут быть вызваны самыми различными причинами. Так растение может оказаться сломленным ветром. Растение должно точно знать, что механическое повреждение - это не специальное нападение извне. Именно для этих целей под действием этиилена клетки выбрасывают в окружающую среду ферменты - хитиназу и b-глюканазу. Напомним, что хитин содержится в насекомых и грибах, а глюкан - компонент растительной клеточной стенки. Ферменты способны до некоторой степени разрушать хитин. Казалось бы, полное разрушение хитина может спасти растение от нападения. К сожалению, хитиназы вырабатывается очень мало.
Перечисленные ферменты образуют олигомерные водорастворимые фрагменты хитина и гликана (олигосахарины -см. ниже). Эти фрагменты воспринимаются клеткой как сигнал опасности. Тогда начинается второй этап ответа на повреждение. Если хитиназа и b-глюканаза не обнаруживают в зоне повреждения грибов, то токсичные вещества перестают вырабатываться (растение экономит силы).

В случае инфекции самый сильный ответ - реакция сверхчувствительности. Пораженная клетка "отключает" систему защиты от активных форм кислорода, образуется очень много перекисей, супероксид-анионов и других свободных радикалов, в результате чего клетка гибнет. Но вместе с ней гибнет и попавший в растение паразит. В развитии реакции сверхчувствительность важную роль играют салициловая и жасминовая кислоты (см. ниже), которые синтезируются в том числе и при действии этилена.

Клетки, которые окружают зону инфекции, начинают синтез токсичных веществ. Если эти вещества синтезируются в процессе инфекции de novo, их называют фитоалексинами. Химическая природа фитоалексинов зависит от систематического положения растения. Так, картофель образует сесквитерпеноидные фитоалексины, у бобовых фитоалексины синтезируются на основе фенольных соединений и т.п.

К высокомолекулярным защитным веществам растений можно отнести лектины. Так называются белки и гликопротеиды, которые обладают способностью связываться с полисахаридами и родственными им соединениями. Определенные группы лектинов способны связываться с хитином в клеточных стенках грибов. Для роста гиф грибов необходимо ослабить связи между хитиновыми волокнами. Но эти волокна оказываются прочно склеенными с помощью растительных лектинов и грибная клеточная стенка не сможет растягиваться. То же самое происходит и с бактериями, которые оказываются склеенными другой группой лектинов.

Кроме перекисей, фитоалексинов и лектинов к месту инфекции транспортируются и ингибиторы протеиназ. Это позволяет остановить разрушение белков растительных клеток в месте инфекции.

Немаловажную роль в защите играет непосредственно этилен. Так, грибы, вызывающие ржавчину, для своего роста нуждаются в полиаминах - путресцине и спермидине (эти вещества продуцируют растения). Полиамины имеют общее звено биосинтеза с этиленом: S-аденозилметионин. Продукция этилена вызывает остановку синтеза полиаминов. Грибы оказываются лишенными фактора роста и гораздо хуже инфицируют растения. Подавление биосинтеза этилена ведет к усилению инфекции, а если ингибируют синтез полиаминов, ржавчина почти не развивается.

Этилен и цветение ананасов.

Цветение ананасов (как и других растений из семейства бромелиевых) можно вызвать обработкой этиленом. В природе бромелиевые цветут, когда им удается набрать некоторый "критический" размер. Но в промышленной культуре это свойство не очень полезно: растения цветут и плодоносят не одновременно.

К счастью, цветение ананасов можно регулировать. В оранжереях Санкт-Петербурга царские садовники применяли такой прием: ананасы вынимали из горшка и несколько дней подвешивали корнями кверху. Механический стресс (подвешивание) вызывает синтез этилена, и именно этот газ вызывает цветение ананасов. Вопрос лишь в том, как добыть этилен и массово обработать им ананасы на плантациях, что бы все они одновременно зацвели.

На Гавайских островах среди ананасов расставляли плошки с нефтепродуктами и поджигали. При неполном сгорании получаются небольшие порции этилена (которых, впрочем, вполне достаточно для стимуляции цветения). На Кубе ананасы поливали карбидной водой. Карбид кальция при взаимодействии с водой дает ацетилен, микрофлора почвы восстанавливает его до этилена, что и нужно для цветения ананасов. Можно рекомендовать поместить горшок с ананасом в полиэтиленовый пакет вместе со спелым бананом и плотно завязать его.

Но в современном сельском хозяйстве эти методы практически не применяют. Существуют химические агенты (например, этрел), которые сами разрушаются в организме растения с образованием этилена. Именно этими препаратами обрабатывают ананасы.

Стимуляция образования цветков не характерна для этилена. Скорее, дело не в этилене, а в эволюционных связях и экологии бромелиевых.

Представители этого семейства распространены в тропиках и субтропиках обеих Америк. Подавляющее большинство бромелиевых обитает на деревьях. Эпифитные бромелиевые ведут необычный образ жизни. Главный поглощающий орган у них не корень а лист. Из листьев бромелиевые образуют плотную воронку, в которой скапливается дождевая вода, пыль и листовой опад, выводят свое потомство комары и лягушки, обитающие в десятках метров от поверхности почвы. Бромеливые создают резервуары воды на большой высоте с уникальной биотой, развивающийся в них. Из резервуара листья впитывают минеральные соли, отсюда же растения "пьют", когда наступает засушливое время. Без воды в розетке листьев бромеливые существовать не могут.

Когда растения вырастают достаточно крупными, они образуют цветонос в самом центре розетки. Разумеется, это происходит в сухой сезон. Розетки в которой развился цветонос и плоды с семенами быстро отмирают и вокруг нее через некоторое время появляются вегетативные потомки - детки.

У всех бромелиевых этилен вызывает цветение в нехарактерное время года. Такой уникальный механизм регуляции цветения можно объяснить исходя из следующей схемы событий. Если по какой-то причине растение потеряло вертикальную ориентацию розетки (ее наклонило животное или растение упало вместе с веткой) это событие может стать фатальным для растения: листья больше не могут быть резервуаром для воды.. Механическое воздействие параллелно вызывает образование этилена. При угрозе гибели обычно интенсифицируются процессы размножения. Таким образом, процесс образования этилена и необходимость размножения совпадают по времени. В этой ситуации этилен может служить сигналом к ускоренному зацветанию. Представители бромелиевых цветут и образуют одновременно боковые побеги (молодые розетки будут правильно ориентированы).

Хотя у ананасов вода не задерживается в розетках и они освоили наземный образ жизни, этилен все еще вызывает такой же ответ, какой был у эпифитных предков ананаса.